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液相色譜柱安裝與使用說明

液相色譜柱安裝與使用說明

液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成,其中液相色譜柱的正確安裝和使用,是液相色譜工作的關鍵;也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數據的必經之路。
   一、液相色譜柱的安裝:
   1、液相色譜柱的結構:
   a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
   柱接頭采用低死體積結構,柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為7/16英寸外螺紋,另一端是3/16英寸的內螺紋(國內外已規範化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,中間放置壓壞用於密封。3/16英寸的內螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,中間也放置壓環用於柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積,在安裝色譜柱時,用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環後要盡量插到底,然後再擰緊空心螺釘。壓環被空心螺釘擠壓變形後緊箍在連接管上(連接管通過壓環後露出的管長度應嚴格控製在25mm或其他固定尺寸)。
   在兩端柱接頭內,柱管兩端各放置一片不鏽鋼濾片(或濾網),用於封堵柱填料不被流動相衝出柱外而流失。空柱各組件均為316#不鏽鋼材質,能耐受一般的溶劑作用。但由於含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
   b、柱填料:
   液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的,柱子的分類是依據填料類型而定。
   正相柱:多以矽膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3—10 µm的範圍內。另一類正相填料是矽膠表麵鍵合—CN,-NH2等官能團即所謂的鍵合相矽膠。
   反相柱:主要是以矽膠為基質,在其表麵鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
   常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑在3—10 µm之間。
   2,色譜柱的安裝:
   a、拆開柱包裝盒,確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。
   b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
   c、 按柱管上標示的流動相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許,建議在柱前使用保護柱);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內徑為0.1-0.3mm的不鏽鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環後盡量用力插到底,然後順時針擰緊空心螺釘,直到擰不動為止,再用扳手繼續順時針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓後有漏液現象,請用扳手繼續順時針擰1/4圈,直至不漏液為止。

   二、液相色譜柱的使用:
   色譜柱在使用前,最好進行柱的性能測試,並將結果保存起來,作為今後評價柱性能變化的參考。但要注意:柱性能可能由於所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外,在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件),隻有這樣,測得的結果才有可比性。
 1、樣品的前處理:
   a、最好使用流動相溶解樣品。
   b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。c、使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
   2、流動相的配製:
   液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點:
   a、流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉澱在柱中(或長時間保留在柱中)。
   b、流動相具有一定惰性,與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。
   c、流動相的黏度要盡量小,以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果;同時降低柱壓降,延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
   d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器,最好使用對紫外吸收較低的溶劑配製。
   e、流動相沸點不要太低,否則容易產生氣泡,導致實驗無法進行。
   f、在流動相配製好後,一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利於檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。

   3、流動相流速的選擇:
   因柱效是柱中流動相線性流速的函數,使用不同的流速可得到不同的柱效。對於一根特定的色譜柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對於內徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
   當選用最佳流速時,分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時,可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

   注意:
   1.由於甲醇廉價,對於反相柱推薦使用甲醇體係必須使用乙腈的場合除外
   2.對於正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純後的己烷作流動相,沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水電阻率大於18兆歐,去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質,有可能影響分析結果。
   3.含水流動相最奸在實驗前配製,尤其是夏天使用緩衝溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉,防止細菌生長。
   4.流動相要求使用0.45 µm濾膜過濾,除去微粒雜質。
   5.使用HPLC級溶劑配製流動相,使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。

   4、柱性能測試:

——啟動液相色譜儀:a、流動相流速設定為1ml/min。
                    b、UV檢測器波長設定為254nm。
——使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。
——記錄並計算測試結果。

*參考標準JB5226-91)液相色譜儀測試用標準色譜柱。
 
 
 
 
常見故障及排除
 
 
 
 
 
柱壓升高
色譜柱入U濾片被流動相或樣品中顆粒堵住。
樣品組分在濾片上沉澱堵住濾片。
卸下入口接頭的濾片,使用1:1的硝酸溶液超聲清洗5min,再用水、
甲醇清洗除去水份。
樣品及流動相使用0.45µm濾膜除去微量雜質。
使用流動相作溶劑配製樣品。
 
 
新柱柱效低
柱外死體積大。
樣品在流動相中溶解不好,影響傳質過程。
更換連接管,重新連接色譜柱,降低死體積。
使用合適的流動相或使用流動相溶解樣品。
 
 
舊色譜柱柱效低,分離不好,柱入口床層塌陷。
填料被流動相溶蝕而流失。
用同型填料填補柱效可部分恢複。
對矽膠質填料,流動相PH值在2—7範圍內,否則可能被溶蝕。
 
 
舊色譜柱柱效低分離不好,有時出現雙峰。
入門填料被汙染變質所致。
用強溶劑衝洗。
刮除被汙染的床層,用同型的填料填補柱效可部分恢複。
汙染嚴重,則廢棄或重新填裝。
 
 
新柱接到儀器上後,柱頭漏液。
柱接頭與儀器之間連接管的壓環變形量不夠。
用扳手順時針方向擰緊1/4圈直到不漏液為止。
 
 
新柱接到儀器上後,啟動儀器沒有柱壓降。
柱放置時間過長柱內充裝的液體己揮發幹。
繼續開泵,用流動相將柱內氣體置換掉。
 
 
新柱接到儀器上後,檢測器出口不斷有小氣泡出
現。
①同上。
② 流動相脫氣不徹底特別是MeOH/H20體係由於氫鍵作用很容易出現氣泡。
①同上。
②配好流動相後一定要進行脫氣處理。
 
 
新柱接到儀器上後柱壓降不斷增加,甚至超過儀器的耐壓限。
柱入口濾片被固體顆粒堵塞(或被毒
菌堵塞)。
更換或清洗柱入口濾片;用0.45µm過濾膜過濾流動相除去微小顆粒物。
 
 
進樣次數增加柱壓降逐漸增加。
①樣品中含有不溶於流動相的微小顆粒物。
②樣品在流動相中析出微小結晶。
①用0.45µm過濾膜過濾樣品。
②推薦使用流動相溶解樣品。
 
 
使用—段時間後,柱效下降,分離不好。
①柱填料被流動相溶解而流失。
②柱填料被樣品雜質汙染。
①推薦使用予柱。如柱床層塌陷,用相同型號填料填補。
②推薦使用保護柱或用強溶劑衝洗色譜柱除去汙染雜質。
 
 
柱使用一段時間後,柱效下降出現雙峰。
柱入口床層被汙染使柱填料變質。
用強溶劑衝洗除去雜質。
 
 
柱使用—段時間後,柱效下降,出現峰拖尾。
柱入口床層被汙染。
用強溶劑衝洗20-30ml,若效果不明顯應廢棄。
 
 
進樣量增大與峰麵積增加不成正比.即進樣量與峰麵積不是線性關係。
樣品在流動相中的溶解度小,隻有部分樣品被流動相衝如色譜柱中而另一部分則沉積在柱人口端。
①用流動相溶解樣品。
②樣品的濃度不宜太大。
④進樣量不宜過大。
 
 
使用緩衝液作流動相時,柱壓降升高很快。
黴菌生長所致。
①在流動相中加入有毒物質或加疊氯化鈉防止黴菌生長。
②實驗結束後先用純水後用MeOH各衝洗20-30ml後關機。
 
 
用5µm顆粒填料柱時, 以MeOH/H20作流動相柱壓較高。
MeOH與水之間由於氫鍵作用黏度增大。
可用乙腈/水體係使柱壓降低,分離效率更好。
 
 
長時間放置的色譜柱,出現雙峰。
柱床層出現幹裂。
柱放置時,最好使用相應的溶劑充填好,防止受大的機械震動,如床層幹裂應廢棄掉。
 
 
流動相洗滌強度由弱漸強時出現很多雜質峰。
強溶劑將弱溶劑洗不出的雜質衝出來。
不影響柱的性能。
 
 
柱使用一段時間後保留值逐漸縮短。
柱中固定相流失所致。
①更換色譜柱。
②檢查所用的色譜條件是否合適。
 
 
在U V色譜圖中,靠近死時間處出現負峰。
①進樣時壓力波動所致。
②樣品溶劑比流動相的UV吸收值低。
①采用閥進樣。
②用流動相溶解樣品。
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